🧫

Αρχές και μεθοδολογία της Βιοτεχνολογίας

Τεύχος Β΄ · Κεφ. 7 · Μικροβιακές καλλιέργειες, ζυμωτήρες, καμπύλη ανάπτυξης, καθαρισμός προϊόντων (εκτός η §πενικιλίνη)

Τι κοινό έχουν το γιαούρτι, η μπίρα και η ινσουλίνη;

Όλα τα «φτιάχνουν» μικροοργανισμοί. Βακτήρια πήζουν το γάλα σε γιαούρτι, ζυμομύκητες μετατρέπουν τα σάκχαρα σε αλκοόλη, και γενετικά τροποποιημένα βακτήρια παράγουν ανθρώπινη ινσουλίνη. Η διαφορά ανάμεσα στο σπιτικό γιαούρτι και σε μια φαρμακοβιομηχανία είναι ο έλεγχος: θρεπτικό υλικό, θερμοκρασία, pH, οξυγόνο και σωστός χρόνος συλλογής.

Τι είναι η Βιοτεχνολογία

Βιοτεχνολογία είναι η χρησιμοποίηση ζωντανών οργανισμών ή μερών τους (κύτταρα, ένζυμα) για την παραγωγή χρήσιμων προϊόντων ή την παροχή υπηρεσιών. Ο άνθρωπος την εφαρμόζει εμπειρικά από την αρχαιότητα (ψωμί, κρασί, τυρί, γιαούρτι). Η σύγχρονη Βιοτεχνολογία συνδυάζει τις μικροβιακές καλλιέργειες με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA.

Οι μικροοργανισμοί (βακτήρια, μύκητες) είναι ιδανικοί «εργάτες» επειδή:

πολλαπλασιάζονται πολύ γρήγορα,
καλλιεργούνται εύκολα σε φθηνά θρεπτικά υλικά,
έχουν ποικίλες μεταβολικές ικανότητες,
τροποποιούνται γενετικά σχετικά εύκολα.

Μικροβιακές καλλιέργειες

Για να αναπτυχθεί ένας μικροοργανισμός χρειάζεται θρεπτικό υλικό (θρεπτικό μέσο) που περιέχει πηγή άνθρακα (π.χ. γλυκόζη) και ενέργειας, πηγή αζώτου, ανόργανα άλατα, νερό και, για ορισμένους, αυξητικούς παράγοντες (π.χ. βιταμίνες). Απαιτούνται επίσης κατάλληλες φυσικοχημικές συνθήκες: θερμοκρασία, pH, οξυγόνο (για τους αερόβιους) ή απουσία του (για τους αναερόβιους).

Πρώτα όλα αποστειρώνονται, ώστε να αναπτυχθεί μόνο ο επιθυμητός μικροοργανισμός (καθαρή καλλιέργεια). Στη συνέχεια γίνεται ο εμβολιασμός με μικρή ποσότητα του μικροοργανισμού.

Εργαστήριο και βιομηχανική κλίμακα

Σε βιομηχανική κλίμακα οι καλλιέργειες γίνονται σε ζυμωτήρες (βιοαντιδραστήρες): μεγάλες δεξαμενές (έως και εκατοντάδες κυβικά μέτρα) όπου ελέγχονται συνεχώς η θερμοκρασία, το pH, η ανάδευση και η παροχή αέρα (οξυγόνου), και από όπου μπορούν να λαμβάνονται δείγματα. Η διαδικασία παραγωγής προϊόντων από μικροοργανισμούς ονομάζεται γενικά ζύμωση.

Η καμπύλη ανάπτυξης

Σε μια κλειστή καλλιέργεια ο πληθυσμός περνά από τέσσερις φάσεις:

Λανθάνουσα φάση: οι μικροοργανισμοί προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον (σύνθεση ενζύμων)· ο αριθμός σχεδόν δεν αυξάνεται.
Εκθετική φάση: ταχύτατος πολλαπλασιασμός· ο πληθυσμός διπλασιάζεται σε σταθερά χρονικά διαστήματα (χρόνος γενεάς).
Στατική φάση: εξαντλούνται θρεπτικά συστατικά και συσσωρεύονται τοξικά προϊόντα· οι νέοι μικροοργανισμοί ισούνται με όσους πεθαίνουν, ο πληθυσμός μένει σταθερός.
Φάση θανάτου: οι θάνατοι υπερτερούν και ο πληθυσμός μειώνεται.

Τα προϊόντα που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη (πρωτογενείς μεταβολίτες, π.χ. αμινοξέα, αιθανόλη) παράγονται κυρίως στην εκθετική φάση, ενώ προϊόντα όπως τα αντιβιοτικά (δευτερογενείς μεταβολίτες) κυρίως στη στατική.

Κόλπο μνήμης

Η καμπύλη ανάπτυξης είναι ένα πάρτι. Λανθάνουσα: οι καλεσμένοι φτάνουν και «προσαρμόζονται», χωρίς να χορεύουν ακόμη. Εκθετική: ο χορός ανάβει, κάθε ζευγάρι φέρνει νέο ζευγάρι. Στατική: το σπίτι γέμισε, όσοι μπαίνουν τόσοι βγαίνουν. Θανάτου: τελείωσαν τα σνακ, όλοι φεύγουν.

$N = N_0 \cdot 2^{\nu}, \qquad \nu = \frac{t}{g} \quad (g = \text{χρόνος γενεάς})$

Ήξερες ότι;

Αν ένα βακτήριο E. coli (μάζας περίπου $10^{-12}\ g$ ) διαιρούνταν κάθε 20 λεπτά χωρίς κανένα όριο για 48 ώρες, θα περνούσε από $144$ γενεές: $2^{144} \approx 2 \cdot 10^{43}$ κύτταρα, με μάζα χιλιάδες φορές μεγαλύτερη από τη μάζα της Γης. Γι' αυτό η εκθετική φάση δεν κρατά για πάντα: τα θρεπτικά συστατικά εξαντλούνται και συσσωρεύονται άχρηστες ουσίες.

Γρήγορος έλεγχος

Σε ποια φάση της καμπύλης ανάπτυξης ο αριθμός των μικροοργανισμών παραμένει σταθερός;

Διαφορετικοί τρόποι καλλιέργειας

Κλειστή καλλιέργεια (διαλείποντος έργου): το θρεπτικό υλικό προστίθεται μία φορά στην αρχή· η καλλιέργεια περνά από όλες τις φάσεις και στο τέλος συλλέγεται το προϊόν. Μετά ο ζυμωτήρας καθαρίζεται και αποστειρώνεται για νέα παραγωγή.
Συνεχής καλλιέργεια: προστίθεται συνεχώς νέο θρεπτικό υλικό και αφαιρείται συνεχώς ίση ποσότητα καλλιέργειας. Ο πληθυσμός διατηρείται στην εκθετική φάση για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Παραλαβή και καθαρισμός των προϊόντων

Μετά τη ζύμωση το προϊόν πρέπει να απομονωθεί από το μείγμα (κύτταρα, υπολείμματα θρεπτικού υλικού, άλλα προϊόντα) και να καθαριστεί. Χρησιμοποιείται σειρά τεχνικών, όπως διήθηση ή φυγοκέντρηση για τον διαχωρισμό των κυττάρων, και στη συνέχεια τεχνικές που απομονώνουν το προϊόν (π.χ. καθίζηση, χρωματογραφία). Αν το προϊόν βρίσκεται μέσα στα κύτταρα, προηγείται η λύση τους. Για φαρμακευτικά προϊόντα απαιτείται πολύ υψηλή καθαρότητα.

Μέθοδος: ασκήσεις μικροβιακής ανάπτυξης

Βρες τον αριθμό γενεών: $\nu = t / g$ (ίδιες μονάδες χρόνου!).
Εφάρμοσε $N = N_0 \cdot 2^{\nu}$ — ισχύει μόνο στην εκθετική φάση.
Αν ζητείται ο χρόνος γενεάς: $2^{\nu} = N / N_0$ → βρες $\nu$ → $g = t / \nu$ .
Σε ερωτήσεις κρίσης: σύνδεσε το προϊόν με τη φάση (πρωτογενής → εκθετική, δευτερογενής → στατική) και τον τρόπο καλλιέργειας (συνεχής για προϊόντα εκθετικής φάσης).

Παράδειγμα 1: Μια καλλιέργεια βακτηρίων ξεκινά την εκθετική φάση με $10^3$ κύτταρα. Ο χρόνος γενεάς είναι 20 min. Πόσα κύτταρα θα υπάρχουν μετά από 2 ώρες εκθετικής ανάπτυξης;

Λύση: $t = 120$ min, $\nu = 120 / 20 = 6$ γενεές. $N = 10^3 \cdot 2^6 = 64 \cdot 10^3 = 6{,}4 \cdot 10^4$ κύτταρα.

Παράδειγμα 2: Σε εκθετική φάση ο πληθυσμός αυξάνεται από $2 \cdot 10^5$ σε $1{,}6 \cdot 10^6$ κύτταρα σε 90 min. Ποιος ο χρόνος γενεάς;

Λύση: $N / N_0 = \frac{1{,}6 \cdot 10^6}{2 \cdot 10^5} = 8 = 2^3$ , άρα $\nu = 3$ . $g = 90 / 3 = 30$ min.

Άσκηση τύπου Πανελλαδικών: Μια εταιρεία θέλει να παράγει (α) ένα αμινοξύ που παράγεται κυρίως κατά την εκθετική φάση και (β) ένα αντιβιοτικό.

Ποιον τρόπο καλλιέργειας θα προτείνατε για το καθένα και γιατί; Ποια βήματα ακολουθούν τη ζύμωση;

Λύση:

(α) Συνεχή καλλιέργεια: με τη συνεχή προσθήκη θρεπτικού υλικού και αφαίρεση καλλιέργειας, ο πληθυσμός διατηρείται για μεγάλο διάστημα στην εκθετική φάση, όπου παράγεται το αμινοξύ (πρωτογενής μεταβολίτης).

(β) Κλειστή καλλιέργεια: τα αντιβιοτικά είναι δευτερογενείς μεταβολίτες και παράγονται κυρίως στη στατική φάση, στην οποία φτάνει η κλειστή καλλιέργεια όταν εξαντλούνται τα θρεπτικά.

Μετά τη ζύμωση ακολουθεί η παραλαβή του προϊόντος: διαχωρισμός των κυττάρων (διήθηση ή φυγοκέντρηση), λύση των κυττάρων αν το προϊόν είναι ενδοκυτταρικό, και σειρά τεχνικών καθαρισμού μέχρι την επιθυμητή καθαρότητα.

Γρήγορος έλεγχος

Γιατί πριν από τον εμβολιασμό ο ζυμωτήρας και το θρεπτικό υλικό αποστειρώνονται;

Γρήγορος έλεγχος

Σε ποιον τρόπο καλλιέργειας ο πληθυσμός διατηρείται για μεγάλο διάστημα στην εκθετική φάση;

Πρόκληση

Μια κλειστή καλλιέργεια εμβολιάζεται με $5 \cdot 10^3$ βακτήρια τη χρονική στιγμή $t = 0$ . Η λανθάνουσα φάση διαρκεί 1 h και στην εκθετική φάση ο χρόνος γενεάς είναι 30 min. Η στατική φάση αρχίζει όταν ο πληθυσμός φτάσει τα $1{,}28 \cdot 10^6$ κύτταρα.

(α) Πόσα κύτταρα υπάρχουν τη στιγμή $t = 4\ h$ ; (β) Πότε αρχίζει η στατική φάση; (γ) Μια δεύτερη καλλιέργεια, στο ίδιο θρεπτικό υλικό, εμβολιάζεται με διπλάσιο αριθμό κυττάρων. Πόσο νωρίτερα θα φτάσει στη στατική φάση;

Δοκίμασε πρώτα μόνος σου — μετά δες τη λύση

(α) Εκθετική ανάπτυξη από $t = 1\ h$ έως $t = 4\ h$ : 3 h = 180 min → $\nu = 180 / 30 = 6$ γενεές. $N = 5 \cdot 10^3 \cdot 2^6 = 5 \cdot 10^3 \cdot 64 = 3{,}2 \cdot 10^5$ κύτταρα. Η παγίδα: να μετρήσεις και τη λανθάνουσα φάση, οπότε θα έβρισκες 8 γενεές.

(β) $\frac{1{,}28 \cdot 10^6}{5 \cdot 10^3} = 256 = 2^8$ → 8 γενεές $= 4\ h$ εκθετικής ανάπτυξης. Μαζί με τη λανθάνουσα φάση: $t = 1 + 4 = 5\ h$ .

(γ) Με $10^4$ κύτταρα χρειάζονται $\frac{1{,}28 \cdot 10^6}{10^4} = 128 = 2^7$ → 7 γενεές. Μία γενεά λιγότερη: φτάνει 30 min νωρίτερα, αφού το όριο της στατικής φάσης το καθορίζει το ίδιο θρεπτικό υλικό.

Συνηθισμένα λάθη

Εφαρμογή του $N = N_0 \cdot 2^{\nu}$ στη στατική φάση ή στη φάση θανάτου — ισχύει μόνο στην εκθετική.
Ανάμειξη μονάδων (ώρες με λεπτά) στο $\nu = t/g$ .
«Στη λανθάνουσα φάση τα κύτταρα είναι αδρανή.» Προσαρμόζονται ενεργά (συνθέτουν ένζυμα).
Σύγχυση κλειστής (μία προσθήκη θρεπτικού) με συνεχή (διαρκής ανανέωση) καλλιέργεια.

Σύνοψη — τι κρατάμε

Βιοτεχνολογία: χρήση ζωντανών οργανισμών ή μερών τους για χρήσιμα προϊόντα· σύγχρονη μορφή με ανασυνδυασμένο DNA.
Καλλιέργεια: θρεπτικό υλικό (C, N, άλατα, νερό), αποστείρωση, εμβολιασμός, έλεγχος θερμοκρασίας–pH–οξυγόνου σε ζυμωτήρες.
Καμπύλη ανάπτυξης: λανθάνουσα, εκθετική ( $N = N_0 \cdot 2^{t/g}$ ), στατική, θανάτου.
Κλειστή καλλιέργεια (όλες οι φάσεις) vs συνεχής (παρατεταμένη εκθετική φάση).
Παραλαβή προϊόντος: διαχωρισμός κυττάρων, καθαρισμός με σειρά τεχνικών.
Η παράγραφος για την παραγωγή της πενικιλίνης είναι εκτός εξεταστέας ύλης.

Τι είναι η Βιοτεχνολογία

Οι μικροοργανισμοί (βακτήρια, μύκητες) είναι ιδανικοί «εργάτες» επειδή:

πολλαπλασιάζονται πολύ γρήγορα,

καλλιεργούνται εύκολα σε φθηνά θρεπτικά υλικά,

έχουν ποικίλες μεταβολικές ικανότητες,

τροποποιούνται γενετικά σχετικά εύκολα.