Ανασυνδυασμένο DNA και γονιδιωματική βιβλιοθήκη

Πώς βάζεις ένα ανθρώπινο γονίδιο μέσα σε ένα βακτήριο;

Με ψαλίδι και κόλλα — μόνο που και τα δύο είναι ένζυμα. Το ψαλίδι κόβει το DNA σε ακριβώς καθορισμένες αλληλουχίες, η κόλλα ενώνει τα κομμάτια, και ένα μικρό κυκλικό DNA κάνει τον «ταχυδρόμο» μέσα στο βακτήριο. Έτσι παράγονται σήμερα φάρμακα όπως η ινσουλίνη.

Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA (γενετική μηχανική) περιλαμβάνει τις τεχνικές με τις οποίες απομονώνουμε ένα τμήμα DNA, το συνδέουμε με άλλο μόριο DNA και το εισάγουμε σε κύτταρο-ξενιστή, ώστε να πολλαπλασιαστεί (κλωνοποίηση) ή να εκφραστεί. Ανασυνδυασμένο είναι το μόριο DNA που προκύπτει από τη σύνδεση τμημάτων DNA διαφορετικής προέλευσης.

Τα βασικά «εργαλεία» είναι:

• οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες, που κόβουν το DNA,
• οι φορείς κλωνοποίησης, που μεταφέρουν το DNA στο κύτταρο-ξενιστή,
• η DNA δεσμάση, που ενώνει τα τμήματα,
• τα κύτταρα-ξενιστές, συνήθως βακτήρια όπως το E. coli.

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Είναι ένζυμα που παράγονται φυσιολογικά από βακτήρια (τα προστατεύουν από το DNA ιών). Κάθε περιοριστική ενδονουκλεάση:

• αναγνωρίζει ειδική αλληλουχία DNA, συνήθως 4–8 ζευγών βάσεων, την αλληλουχία αναγνώρισης,
• κόβει το DNA σε συγκεκριμένη θέση μέσα σε αυτή, σπάζοντας φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

Το πιο γνωστό παράδειγμα είναι η EcoRI, που αναγνωρίζει την αλληλουχία

$$5΄\text{-GAATTC-}3΄ \qquad 3΄\text{-CTTAAG-}5΄$$

και κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα στο G και στο A (με κατεύθυνση 5΄ → 3΄). Έτσι δημιουργούνται μονόκλωνα άκρα 5΄-AATT, που είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους. Οποιαδήποτε δύο τμήματα κομμένα με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση μπορούν να ενωθούν μέσω των μονόκλωνων άκρων τους με δεσμούς υδρογόνου, και η DNA δεσμάση σχηματίζει στη συνέχεια τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

Η αλληλουχία αναγνώρισης διαβάζεται ίδια και στις δύο αλυσίδες με κατεύθυνση 5΄ → 3΄.

Φορείς κλωνοποίησης και μετασχηματισμός

Φορείς κλωνοποίησης είναι μόρια DNA που μπορούν να αυτοδιπλασιάζονται μέσα στο κύτταρο-ξενιστή. Οι πιο συνηθισμένοι είναι:

• τα πλασμίδια των βακτηρίων,
• το DNA βακτηριοφάγων (ιών βακτηρίων).

Ένας καλός φορέας έχει μία θέση αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση που χρησιμοποιούμε και φέρει γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό, που χρησιμεύει ως γονίδιο-δείκτης για την επιλογή.

Διαδικασία δημιουργίας ανασυνδυασμένου πλασμιδίου:

1. Το DNA-δότης και τα πλασμίδια κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση.
2. Τα τμήματα αναμειγνύονται· τα συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα ενώνονται με δεσμούς υδρογόνου και η DNA δεσμάση τα συνδέει.
3. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια (μετασχηματισμός).
4. Τα βακτήρια καλλιεργούνται παρουσία του αντιβιοτικού: επιβιώνουν μόνο όσα πήραν πλασμίδιο.
5. Κάθε βακτήριο πολλαπλασιάζεται και δίνει έναν κλώνο: πληθυσμό γενετικά όμοιων κυττάρων που φέρουν το ίδιο ανασυνδυασμένο DNA.

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη

Όταν ολόκληρο το γονιδίωμα ενός οργανισμού κοπεί με περιοριστική ενδονουκλεάση και όλα τα τμήματα κλωνοποιηθούν, προκύπτει η γονιδιωματική βιβλιοθήκη: το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν ολόκληρο το γονιδίωμα του οργανισμού, κατακερματισμένο σε τμήματα.

• Περιέχει όλο το DNA: γονίδια με εσώνια και εξώνια, υποκινητές, ρυθμιστικές αλληλουχίες και DNA που δεν κωδικοποιεί.
• Είναι ίδια ανεξάρτητα από τον τύπο κυττάρου από τον οποίο πήραμε το DNA, αφού όλα τα σωματικά κύτταρα έχουν το ίδιο γονιδίωμα.
• Επειδή περιέχει εσώνια, ένα ευκαρυωτικό γονίδιο από γονιδιωματική βιβλιοθήκη δεν μπορεί να εκφραστεί σωστά σε βακτήριο.

Μέθοδος: ασκήσεις με περιοριστικές ενδονουκλεάσες

1. Γράψε την αλληλουχία αναγνώρισης 5΄ → 3΄ και ψάξε την και στις δύο αλυσίδες (λόγω συμμετρίας αρκεί η μία, αλλά έλεγξε).
2. Σημείωσε τη θέση τομής σε κάθε αλυσίδα (EcoRI: G↓AATTC).
3. Μέτρησε τις θέσεις $k$: γραμμικό → $k+1$ τμήματα· κυκλικό → $k$ τμήματα.
4. Για να κλωνοποιηθεί ένα γονίδιο ακέραιο, η ενδονουκλεάση δεν πρέπει να έχει θέση μέσα στο γονίδιο και πρέπει να κόβει εκατέρωθεν αυτού.
5. Ο φορέας πρέπει να κόβεται στο ίδιο ένζυμο, σε θέση που δεν καταστρέφει το γονίδιο ανθεκτικότητας-δείκτη.