Αντιγραφή του DNA
Τεύχος Β΄ · Κεφ. 2 · Ημισυντηρητικός μηχανισμός και ένζυμα της αντιγραφής
Πώς αντιγράφεις 6 δισεκατομμύρια γράμματα σχεδόν χωρίς λάθος;
Κάθε φορά που ένα κύτταρό σου ετοιμάζεται να διαιρεθεί, πρέπει να αντιγράψει περίπου 6 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων σε λίγες ώρες. Και τα λάθη που τελικά μένουν είναι περίπου 1 στα νουκλεοτίδια — σαν να αντέγραφες με το χέρι χιλιάδες βιβλία χωρίς ούτε ένα ορθογραφικό. Δες ποια «ομάδα» ενζύμων το καταφέρνει.
Ο ημισυντηρητικός μηχανισμός
Οι Watson και Crick πρότειναν ότι, αφού οι δύο αλυσίδες είναι συμπληρωματικές, κάθε μία μπορεί να χρησιμεύσει ως καλούπι για τη σύνθεση μιας νέας. Κατά την αντιγραφή:
- οι δύο αλυσίδες του μητρικού μορίου αποχωρίζονται,
- κάθε μία χρησιμεύει ως καλούπι για τη σύνθεση μιας νέας συμπληρωματικής αλυσίδας,
- κάθε θυγατρικό μόριο αποτελείται από μία παλιά (μητρική) και μία νέα αλυσίδα.
Ο μηχανισμός αυτός ονομάζεται ημισυντηρητικός και επιβεβαιώθηκε πειραματικά. Τα δύο θυγατρικά μόρια είναι πανομοιότυπα μεταξύ τους και με το μητρικό.
Ο ημισυντηρητικός μηχανισμός επιβεβαιώθηκε το 1958 από τους Matthew Meselson και Franklin Stahl, με βακτήρια που καλλιεργήθηκαν πρώτα σε «βαρύ» άζωτο () και μετά σε κανονικό (). Το πείραμα έχει μείνει γνωστό ως «το πιο όμορφο πείραμα της Βιολογίας» — θα δεις τη λογική του στα παραδείγματα.
Τα ένζυμα της αντιγραφής
- Η αντιγραφή ξεκινά σε συγκεκριμένες θέσεις, τις θέσεις έναρξης της αντιγραφής: μία στο κυκλικό DNA των βακτηρίων, πολλές σε κάθε μόριο DNA των ευκαρυωτικών (ώστε η αντιγραφή να ολοκληρώνεται γρήγορα).
- Οι DNA ελικάσες σπάνε τους δεσμούς υδρογόνου και ξετυλίγουν τη διπλή έλικα. Σχηματίζονται οι τοπικά ανοιγμένες περιοχές με δύο διχάλες αντιγραφής· η αντιγραφή προχωρά και προς τις δύο κατευθύνσεις.
- Οι DNA πολυμεράσες δεν μπορούν να αρχίσουν τη σύνθεση από το μηδέν. Ένα σύμπλοκο ενζύμων, το πριμόσωμα, συνθέτει μικρά τμήματα RNA, τα πρωταρχικά τμήματα, συμπληρωματικά προς το καλούπι.
- Οι DNA πολυμεράσες επιμηκύνουν τα πρωταρχικά τμήματα, προσθέτοντας δεοξυριβονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς το καλούπι. Η σύνθεση γίνεται πάντα με κατεύθυνση 5΄ → 3΄ (προσθήκη στο 3΄ άκρο).
- Τα πρωταρχικά τμήματα RNA απομακρύνονται και αντικαθίστανται από DNA από τις DNA πολυμεράσες.
- Η DNA δεσμάση συνδέει με φωσφοδιεστερικό δεσμό τα κομμάτια της νέας αλυσίδας.
Σκέψου ένα συνεργείο βαψίματος. Η ελικάση ανοίγει τον τοίχο (ξετυλίγει). Το πριμόσωμα βάζει το αστάρι — στα αγγλικά το πρωταρχικό τμήμα λέγεται primer, όπως και το αστάρι της μπογιάς. Η DNA πολυμεράση χτίζει πάνω στο αστάρι, μόνο 5΄ → 3΄. Η DNA δεσμάση κολλάει τα κομμάτια. Σειρά: ανοίγω – ασταρώνω – χτίζω – κολλάω.
Συνεχής και ασυνεχής σύνθεση
Επειδή οι αλυσίδες είναι αντιπαράλληλες και η σύνθεση γίνεται μόνο 5΄ → 3΄, σε κάθε διχάλα:
- η μία νέα αλυσίδα συντίθεται συνεχώς, προς την κατεύθυνση που ανοίγει η διχάλα,
- η άλλη συντίθεται ασυνεχώς, σε μικρά κομμάτια (κομμάτια Okazaki), καθένα με δικό του πρωταρχικό τμήμα, τα οποία ενώνει τελικά η DNA δεσμάση.
Ακρίβεια: επιδιορθωτικά ένζυμα
Οι DNA πολυμεράσες έχουν και επιδιορθωτική δράση: ελέγχουν αν το νουκλεοτίδιο που πρόσθεσαν είναι το σωστό και, αν όχι, το απομακρύνουν και το αντικαθιστούν. Επιπλέον, επιδιορθωτικά ένζυμα διορθώνουν βλάβες του DNA. Έτσι τα λάθη της αντιγραφής περιορίζονται σε περίπου 1 στα νουκλεοτίδια. Όσα λάθη διαφύγουν αποτελούν μεταλλάξεις.
Ποιο ένζυμο συνθέτει τα πρωταρχικά τμήματα της αντιγραφής;
Μέθοδος: ασκήσεις αντιγραφής
- Προσανατολισμός: σημείωσε 5΄ και 3΄ στο καλούπι· η νέα αλυσίδα είναι αντιπαράλληλη και μεγαλώνει 5΄ → 3΄.
- Συνεχής ή ασυνεχής; Αν η νέα αλυσίδα μεγαλώνει (5΄ → 3΄) προς το άνοιγμα της διχάλας → συνεχής· αν αντίθετα → ασυνεχής.
- Πρωταρχικά τμήματα: ένα για κάθε συνεχή αλυσίδα και ένα για κάθε κομμάτι Okazaki.
- Γενιές: μετά από αντιγραφές, μόρια· μόνο 2 έχουν μητρική αλυσίδα (ημισυντηρητικός), και οι μητρικές αλυσίδες είναι πάντα 2.
Παράδειγμα 1: Βακτήριο καλλιεργείται σε θρεπτικό υλικό με «βαρύ» άζωτο () ώστε όλο το DNA του να είναι σημασμένο και μεταφέρεται σε υλικό με κανονικό άζωτο (). Μετά από 3 αντιγραφές, πόσα μόρια DNA είναι υβριδικά () και πόσα μόνο ;
Λύση: Μετά από 3 αντιγραφές: μόρια. Οι 2 μητρικές αλυσίδες βρίσκονται σε 2 υβριδικά μόρια. Τα υπόλοιπα 6 είναι μόνο . Κανένα μόριο δεν είναι εξ ολοκλήρου — αυτό αποκλείει τον «συντηρητικό» μηχανισμό.
Παράδειγμα 2: Ένα γραμμικό μόριο DNA ευκαρυωτικού κυττάρου έχει 3 θέσεις έναρξης αντιγραφής. Πόσες διχάλες αντιγραφής σχηματίζονται και πόσα τουλάχιστον πρωταρχικά τμήματα αντιστοιχούν σε συνεχή σύνθεση;
Λύση: Κάθε θέση έναρξης ανοίγει μια περιοχή με 2 διχάλες (αμφίδρομη αντιγραφή): 6 διχάλες. Σε κάθε διχάλα υπάρχει μία συνεχώς συντιθέμενη αλυσίδα με ένα πρωταρχικό τμήμα: 6 πρωταρχικά για τη συνεχή σύνθεση (τα κομμάτια Okazaki χρειάζονται επιπλέον πρωταρχικά).
Άσκηση τύπου Πανελλαδικών: Σε μια διχάλα αντιγραφής η αλυσίδα-καλούπι Ι έχει προσανατολισμό 3΄ → 5΄ προς την κατεύθυνση που ανοίγει η διχάλα, ενώ η ΙΙ έχει προσανατολισμό 5΄ → 3΄ προς την ίδια κατεύθυνση.
(α) Σε ποια αλυσίδα-καλούπι η νέα αλυσίδα συντίθεται συνεχώς; (β) Να περιγράψετε τον ρόλο της DNA δεσμάσης στην άλλη.
Λύση:
(α) Η νέα αλυσίδα είναι αντιπαράλληλη προς το καλούπι. Απέναντι από το καλούπι Ι (3΄ → 5΄ προς τη διχάλα) η νέα αλυσίδα έχει προσανατολισμό 5΄ → 3΄ προς τη διχάλα, άρα μπορεί να επιμηκύνεται συνεχώς καθώς η διχάλα ανοίγει: συνεχής σύνθεση πάνω στο καλούπι Ι.
(β) Στο καλούπι ΙΙ η νέα αλυσίδα πρέπει να συντίθεται 5΄ → 3΄ αντίθετα από τη διχάλα, άρα ασυνεχώς σε κομμάτια Okazaki. Αφού οι DNA πολυμεράσες αντικαταστήσουν τα πρωταρχικά τμήματα RNA με DNA, η DNA δεσμάση συνδέει τα διαδοχικά κομμάτια με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς, ώστε να προκύψει ενιαία αλυσίδα.
Ένα μόριο DNA αντιγράφεται 4 φορές. Πόσες από τις αλυσίδες όλων των μορίων που προκύπτουν είναι νέες;
Ποια πρόταση για τις DNA πολυμεράσες είναι σωστή;
Βακτήρια με DNA σημασμένο εξ ολοκλήρου με μεταφέρονται σε θρεπτικό υλικό με για 2 αντιγραφές και μετά ξανά σε υλικό με για 1 αντιγραφή. Ξεκίνα από ένα μόριο DNA.
(α) Πόσα μόρια DNA υπάρχουν στο τέλος και ποια είναι η σύστασή τους; (β) Πόσες από όλες τις αλυσίδες περιέχουν ;
Δοκίμασε πρώτα μόνος σου — μετά δες τη λύση
Ακολούθησε τις αλυσίδες, όχι τα μόρια (H = αλυσίδα με , L = αλυσίδα με ):
- Αρχή: 1 μόριο H/H.
- 1η αντιγραφή σε : οι αλυσίδες H αποχωρίζονται και καθεμία παίρνει νέα L → 2 H/L.
- 2η αντιγραφή σε : από κάθε H/L προκύπτει ένα H/L και ένα L/L → 2 H/L + 2 L/L (4 μόρια).
- 3η αντιγραφή σε : οι 8 αλυσίδες (2 H και 6 L) αποχωρίζονται και καθεμία παίρνει νέα H.
(α) 8 μόρια: 2 H/H (από τις 2 παλιές αλυσίδες H) και 6 L/H (υβριδικά). Κανένα μόριο δεν είναι μόνο . Προσοχή: τα 2 μόρια H/H δεν είναι το αρχικό μόριο· καθένα έχει μία παλιά και μία νέα αλυσίδα, όπως απαιτεί ο ημισυντηρητικός μηχανισμός.
(β) Αλυσίδες με : (στα H/H) (στα L/H) από τις 16.
- «Η DNA πολυμεράση ξεκινά τη σύνθεση.» Χρειάζεται πρωταρχικό τμήμα RNA από το πριμόσωμα.
- «Η ασυνεχής σύνθεση γίνεται 3΄ → 5΄.» Και οι δύο νέες αλυσίδες συντίθενται 5΄ → 3΄· η διαφορά είναι η κατεύθυνση ως προς τη διχάλα.
- «Στο βακτήριο υπάρχουν πολλές θέσεις έναρξης.» Στο κυκλικό βακτηριακό DNA υπάρχει μία.
- Ξεχνάμε ότι τα πρωταρχικά τμήματα είναι RNA και ότι αντικαθίστανται από DNA.
- Ημισυντηρητικός μηχανισμός: κάθε θυγατρικό μόριο έχει μία μητρική και μία νέα αλυσίδα.
- Θέσεις έναρξης: μία στα βακτήρια, πολλές στα ευκαρυωτικά· αμφίδρομη αντιγραφή με δύο διχάλες.
- Ελικάσες (ξετύλιγμα) → πριμόσωμα (πρωταρχικά RNA) → DNA πολυμεράσες (5΄ → 3΄) → DNA δεσμάση (σύνδεση).
- Συνεχής σύνθεση στη μία αλυσίδα, ασυνεχής (κομμάτια Okazaki) στην άλλη.
- Επιδιορθωτική δράση πολυμερασών και επιδιορθωτικά ένζυμα: περίπου 1 λάθος στα νουκλεοτίδια.