Βιοτεχνολογία στην Ιατρική: φαρμακευτικές πρωτεΐνες, αντισώματα, εμβόλια, αντιβιοτικά
Τεύχος Β΄ · Κεφ. 8 · Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια, μονοκλωνικά αντισώματα, εμβόλια, αντιβιοτικά
Από πού ερχόταν η ινσουλίνη πριν από το 1982;
Για δεκαετίες, οι άνθρωποι με διαβήτη έπαιρναν ινσουλίνη που απομονωνόταν από το πάγκρεας χοίρων και βοοειδών από σφαγεία. Το 1982 εγκρίθηκε η πρώτη ανθρώπινη ινσουλίνη που παρήχθη από γενετικά τροποποιημένα βακτήρια — το πρώτο φαρμακευτικό προϊόν της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA. Δες πώς ένα βακτήριο «μαθαίνει» να φτιάχνει ανθρώπινη πρωτεΐνη.
Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από γενετικά τροποποιημένα βακτήρια
Πριν από τη γενετική μηχανική, πολλές φαρμακευτικές πρωτεΐνες απομονώνονταν από ζώα ή από ανθρώπινους ιστούς (π.χ. ινσουλίνη από πάγκρεας χοίρων και βοοειδών), σε μικρές ποσότητες, με υψηλό κόστος και κίνδυνο αλλεργιών ή μολύνσεων.
Σήμερα πλήθος φαρμακευτικών πρωτεϊνών συντίθενται από βακτήρια με μεθόδους γενετικής μηχανικής:
- Απομονώνεται το ανθρώπινο γονίδιο (συνήθως ως cDNA, χωρίς εσώνια).
- Συνδέεται με βακτηριακό υποκινητή σε φορέα (πλασμίδιο).
- Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται σε βακτήρια (μετασχηματισμός) και επιλέγονται οι κατάλληλοι κλώνοι.
- Τα βακτήρια καλλιεργούνται σε ζυμωτήρες και η πρωτεΐνη απομονώνεται και καθαρίζεται.
Παραδείγματα: ινσουλίνη (σακχαρώδης διαβήτης — ήταν το πρώτο φαρμακευτικό προϊόν ανασυνδυασμένου DNA), αυξητική ορμόνη (νανισμός), ιντερφερόνες (ιογενείς λοιμώξεις, ορισμένοι καρκίνοι), παράγοντας VIII πήξης (αιμορροφιλία), ενεργοποιητής του πλασμινογόνου (διάλυση θρόμβων).
Περιορισμός: τα βακτήρια δεν κάνουν ωρίμανση ούτε πολλές από τις τροποποιήσεις που υφίστανται οι ανθρώπινες πρωτεΐνες μετά τη μετάφραση. Πρωτεΐνες που τις χρειάζονται παράγονται σε ευκαρυωτικά κύτταρα ή σε διαγονιδιακά ζώα.
Γιατί για την παραγωγή ανθρώπινης πρωτεΐνης σε βακτήρια χρησιμοποιείται cDNA και όχι το γονίδιο από το γονιδίωμα;
Μονοκλωνικά αντισώματα
Τα αντισώματα είναι πρωτεΐνες που παράγονται από τα Β-λεμφοκύτταρα (πλασματοκύτταρα) και προσδένονται ειδικά σε ένα αντιγόνο. Κάθε Β-λεμφοκύτταρο παράγει ένα είδος αντισώματος, αλλά δεν επιβιώνει σε καλλιέργεια.
Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων:
- Ένα ποντίκι ανοσοποιείται με το αντιγόνο.
- Από τον σπλήνα του απομονώνονται Β-λεμφοκύτταρα που παράγουν αντισώματα.
- Τα λεμφοκύτταρα συντήκονται με καρκινικά κύτταρα (μυελώματος), που διαιρούνται απεριόριστα. Προκύπτουν τα υβριδώματα, που συνδυάζουν την παραγωγή συγκεκριμένου αντισώματος με την ικανότητα συνεχούς διαίρεσης.
- Επιλέγεται και καλλιεργείται το υβρίδωμα που παράγει το επιθυμητό αντίσωμα. Ο κλώνος του παράγει μεγάλες ποσότητες πανομοιότυπων αντισωμάτων — γι' αυτό λέγονται μονοκλωνικά.
Εφαρμογές: διάγνωση (π.χ. τεστ κύησης, ανίχνευση ιών και ασθενειών), προσδιορισμός ομάδων αίματος, έλεγχος ιστοσυμβατότητας πριν από μεταμοσχεύσεις, θεραπεία καρκίνου (αντισώματα συνδεδεμένα με φάρμακα ή τοξίνες που στοχεύουν μόνο τα καρκινικά κύτταρα).
Το υβρίδωμα είναι «ειδικός που δεν πεθαίνει». Από το Β-λεμφοκύτταρο παίρνει την ειδίκευση: ξέρει να φτιάχνει ένα συγκεκριμένο αντίσωμα. Από το καρκινικό κύτταρο παίρνει την αθανασία: διαιρείται απεριόριστα στην καλλιέργεια.
Εμβόλια
Τα εμβόλια προκαλούν ενεργητική ανοσία: ο οργανισμός έρχεται σε επαφή με αντιγόνα του παθογόνου χωρίς να αρρωστήσει και αναπτύσσει κύτταρα μνήμης.
- Συμβατικά εμβόλια: περιέχουν νεκρούς ή εξασθενημένους μικροοργανισμούς ή αδρανοποιημένες τοξίνες. Υπάρχει ένας μικρός κίνδυνος το παθογόνο να μην έχει αδρανοποιηθεί πλήρως.
- Εμβόλια με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA: περιέχουν μόνο ένα αντιγόνο (π.χ. πρωτεΐνη του περιβλήματος του ιού), που παράγεται από γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς. Παράδειγμα: το εμβόλιο της ηπατίτιδας Β, όπου το γονίδιο της πρωτεΐνης επιφανείας του ιού εκφράζεται σε ζυμομύκητες. Επειδή δεν περιέχουν το γενετικό υλικό του παθογόνου, είναι ασφαλέστερα.
Αντιβιοτικά
Τα αντιβιοτικά είναι ουσίες που παράγονται από μικροοργανισμούς (κυρίως μύκητες και βακτήρια) και αναστέλλουν την ανάπτυξη ή σκοτώνουν άλλους μικροοργανισμούς, κυρίως βακτήρια. Δεν δρουν στους ιούς. Παράγονται βιομηχανικά σε ζυμωτήρες. Η αλόγιστη χρήση τους ευνοεί την επιλογή ανθεκτικών στελεχών βακτηρίων (τα γονίδια ανθεκτικότητας βρίσκονται συχνά σε πλασμίδια, που μεταφέρονται μεταξύ βακτηρίων).
Τι είναι τα υβριδώματα;
Τα πρώτα υβριδώματα τα έφτιαξαν το 1975 οι Georges Köhler και César Milstein, ενώνοντας Β-λεμφοκύτταρα ποντικού με καρκινικά κύτταρα. Για την τεχνική αυτή πήραν το Νόμπελ Ιατρικής του 1984· σήμερα τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται παντού, από τα τεστ κύησης μέχρι τη θεραπεία του καρκίνου.
Μέθοδος: ερωτήσεις εφαρμογών στην Ιατρική
- Ποιο προϊόν; Πρωτεΐνη (ορμόνη, παράγοντας), αντίσωμα, αντιγόνο (εμβόλιο) ή αντιβιοτικό;
- Ποιος το παράγει; Γενετικά τροποποιημένο βακτήριο, ζυμομύκητας, υβρίδωμα ή φυσικός μικροοργανισμός;
- Ποια εργαλεία; cDNA, περιοριστικές ενδονουκλεάσες, φορέας, DNA δεσμάση, βακτηριακός υποκινητής, επιλογή με αντιβιοτικό.
- Πλεονέκτημα έναντι της παλιάς μεθόδου: μεγάλη ποσότητα, χαμηλό κόστος, ανθρώπινη μορφή (λιγότερες αλλεργίες), ασφάλεια.
Παράδειγμα 1: Ποια πλεονεκτήματα έχει η ινσουλίνη από γενετικά τροποποιημένα βακτήρια σε σχέση με την ινσουλίνη από πάγκρεας ζώων;
Λύση: Είναι πανομοιότυπη με την ανθρώπινη (λιγότερες αλλεργικές αντιδράσεις), παράγεται σε μεγάλες ποσότητες και χαμηλότερο κόστος, δεν εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα ζωικών οργάνων και δεν υπάρχει κίνδυνος μετάδοσης ασθενειών από ζώα.
Παράδειγμα 2: Γιατί το ανασυνδυασμένο εμβόλιο της ηπατίτιδας Β δεν μπορεί να προκαλέσει την ασθένεια;
Λύση: Περιέχει μόνο την πρωτεΐνη επιφανείας του ιού, που παράγεται από ζυμομύκητες, και όχι το γενετικό υλικό του ιού. Χωρίς γενετικό υλικό ο ιός δεν μπορεί να πολλαπλασιαστεί, ενώ το αντιγόνο αρκεί για να προκαλέσει την ανοσοβιολογική απόκριση.
Άσκηση τύπου Πανελλαδικών: Ένα τεστ κύησης ανιχνεύει στα ούρα την ορμόνη hCG με μονοκλωνικά αντισώματα.
(α) Περιγράψτε τα στάδια παραγωγής των μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά της hCG. (β) Γιατί χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά και όχι αντισώματα από τον ορό ανοσοποιημένου ζώου;
Λύση:
(α) Ανοσοποίηση ποντικού με hCG → απομόνωση Β-λεμφοκυττάρων από τον σπλήνα → σύντηξη με καρκινικά κύτταρα → υβριδώματα → επιλογή του υβριδώματος που παράγει αντίσωμα κατά της hCG → καλλιέργεια του κλώνου και συλλογή των αντισωμάτων.
(β) Τα μονοκλωνικά αντισώματα προέρχονται από έναν κλώνο και είναι πανομοιότυπα: αναγνωρίζουν ειδικά την ίδια περιοχή του αντιγόνου και παράγονται σε απεριόριστη ποσότητα με σταθερή ποιότητα. Ο ορός ζώου περιέχει μείγμα διαφορετικών αντισωμάτων σε περιορισμένη ποσότητα, άρα δίνει λιγότερο αξιόπιστα αποτελέσματα.
Σε ποια περίπτωση ένα αντιβιοτικό δεν είναι αποτελεσματικό;
Ένα τμήμα της κωδικής αλυσίδας ενός ανθρώπινου γονιδίου είναι:
5΄-ATGTTTTGACCTAAGGGCTGGTAA-3΄
Το τμήμα 5΄-TGACCTAAG-3΄, που ακολουθεί το 6ο νουκλεοτίδιο, είναι εσώνιο. Δίνονται: AUG → Met, UUU → Phe, GGC → Gly, UGG → Trp, UGA και UAA → λήξη.
(α) Ποιο πεπτίδιο παράγει το ανθρώπινο κύτταρο; (β) Το τμήμα αυτό, όπως είναι στο γονιδίωμα, εισάγεται σε βακτήριο μαζί με βακτηριακό υποκινητή. Ποιο πεπτίδιο θα παραχθεί; (γ) Πώς θα διορθώσεις το πρόβλημα;
Δοκίμασε πρώτα μόνος σου — μετά δες τη λύση
(α) Η ωρίμανση αφαιρεί το εσώνιο: ώριμο mRNA 5΄-AUG UUU GGC UGG UAA-3΄ → Met–Phe–Gly–Trp.
(β) Το βακτήριο δεν κάνει ωρίμανση, οπότε μεταφράζει και το εσώνιο: 5΄-AUG UUU UGA CCU…-3΄. Το 3ο κωδικόνιο, UGA, είναι κωδικόνιο λήξης → παράγεται μόνο το Met–Phe. Το εσώνιο έχει 9 νουκλεοτίδια, άρα δεν μετατοπίζει το πλαίσιο — αλλά περιέχει κωδικόνιο λήξης στο ίδιο πλαίσιο.
(γ) Χρησιμοποιείς cDNA, φτιαγμένο με αντίστροφη μεταγραφάση από το ώριμο mRNA, που δεν περιέχει εσώνια, και το συνδέεις με βακτηριακό υποκινητή σε πλασμίδιο. Τότε το βακτήριο παράγει Met–Phe–Gly–Trp.
- «Το cDNA εκφράζεται στο βακτήριο με τον δικό του υποκινητή.» Χρειάζεται βακτηριακό υποκινητή.
- «Τα μονοκλωνικά αντισώματα παράγονται από βακτήρια.» Παράγονται από υβριδώματα.
- «Τα αντιβιοτικά σκοτώνουν ιούς.» Δρουν σε βακτήρια.
- Σύγχυση εμβολίου (αντιγόνο → ενεργητική ανοσία) με αντίσωμα.
- Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια: cDNA + βακτηριακός υποκινητής + φορέας → μετασχηματισμός → ζυμωτήρας → καθαρισμός (ινσουλίνη, αυξητική ορμόνη, ιντερφερόνες, παράγοντας VIII).
- Μονοκλωνικά αντισώματα: Β-λεμφοκύτταρα + καρκινικά κύτταρα → υβριδώματα → πανομοιότυπα αντισώματα· διάγνωση, ομάδες αίματος, μεταμοσχεύσεις, καρκίνος.
- Εμβόλια: συμβατικά (νεκρά/εξασθενημένα) και ανασυνδυασμένα (αντιγόνο, π.χ. ηπατίτιδα Β σε ζυμομύκητες).
- Αντιβιοτικά: από μικροοργανισμούς, δρουν σε βακτήρια, όχι σε ιούς· κίνδυνος ανθεκτικότητας.