cDNA βιβλιοθήκη, υβριδοποίηση και PCR
Τεύχος Β΄ · Κεφ. 4 · Κλωνοποίηση mRNA, ανιχνευτές, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Πώς βρίσκεις έναν ιό σε ένα μπατονάκι από τη μύτη σου;
Στα τεστ μοριακής διάγνωσης για τον SARS-CoV-2, ο ιός — που έχει γενετικό υλικό RNA — ανιχνευόταν με RT-PCR: πρώτα η αντίστροφη μεταγραφάση μετέτρεπε το RNA του σε DNA και μετά η PCR πολλαπλασίαζε ένα συγκεκριμένο κομμάτι του δισεκατομμύρια φορές, ώστε να γίνει ανιχνεύσιμο. Και τα δύο εργαλεία τα μαθαίνεις εδώ.
cDNA βιβλιοθήκη
Αντί για όλο το DNA μπορούμε να κλωνοποιήσουμε τα mRNA ενός κυττάρου. Επειδή το RNA δεν κλωνοποιείται απευθείας, το μετατρέπουμε σε DNA:
- Απομονώνουμε το ώριμο mRNA από κύτταρα ενός συγκεκριμένου ιστού.
- Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει μια αλυσίδα DNA συμπληρωματική προς κάθε mRNA. Προκύπτει ένα υβριδικό μόριο mRNA–DNA.
- Το mRNA αποικοδομείται και η DNA πολυμεράση συνθέτει τη δεύτερη αλυσίδα DNA.
- Το δίκλωνο cDNA (συμπληρωματικό DNA) εισάγεται σε φορείς κλωνοποίησης και σε βακτήρια.
Το σύνολο των κλώνων αποτελεί την cDNA βιβλιοθήκη.
Γονιδιωματική και cDNA βιβλιοθήκη
- Η cDNA βιβλιοθήκη περιέχει μόνο τα γονίδια που εκφράζονται στον συγκεκριμένο ιστό, τη στιγμή της απομόνωσης — άρα διαφέρει από ιστό σε ιστό.
- Το cDNA δεν περιέχει εσώνια (προέρχεται από ώριμο mRNA), ούτε υποκινητή και άλλες ρυθμιστικές αλληλουχίες· περιέχει όμως τις 5΄ και 3΄ αμετάφραστες περιοχές.
- Γι' αυτό η cDNA βιβλιοθήκη είναι κατάλληλη για την παραγωγή ευκαρυωτικών πρωτεϊνών από βακτήρια, που δεν κάνουν ωρίμανση.
Ποιο από τα παρακάτω περιέχεται σε έναν κλώνο cDNA βιβλιοθήκης;
Εντοπισμός του κλώνου: υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων
Μια βιβλιοθήκη περιέχει χιλιάδες κλώνους. Για να βρούμε εκείνον που φέρει το γονίδιο που μας ενδιαφέρει, χρησιμοποιούμε ανιχνευτές: μονόκλωνα μόρια DNA ή RNA σημασμένα (ραδιενεργά ή με φθορίζουσες ουσίες), με αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα τμήμα του γονιδίου.
- Οι αποικίες μεταφέρονται σε ειδικό φίλτρο (αποτύπωμα της τρυβλίου).
- Τα κύτταρα λύονται και το DNA τους αποδιατάσσεται (οι αλυσίδες αποχωρίζονται) ώστε να γίνει μονόκλωνο.
- Προστίθεται ο ανιχνευτής, που υβριδοποιείται (ζευγαρώνει με δεσμούς υδρογόνου) μόνο με το συμπληρωματικό DNA.
- Εντοπίζεται η θέση του σήματος (π.χ. με αυτοραδιογραφία) και από το αρχικό τρυβλίο απομονώνεται ο αντίστοιχος κλώνος.
Η υβριδοποίηση στηρίζεται στη συμπληρωματικότητα των βάσεων.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Η PCR επιτρέπει τον επιλεκτικό πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA χωρίς κλωνοποίηση σε κύτταρα, ακόμη και από ελάχιστη ποσότητα αρχικού υλικού. Χρειάζονται:
- το DNA-στόχος,
- δύο εκκινητές (primers): μικρά συνθετικά μόρια DNA συμπληρωματικά προς τα άκρα του τμήματος-στόχου,
- δεοξυριβονουκλεοτίδια,
- θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση, που δεν μετουσιώνεται στις υψηλές θερμοκρασίες.
Κάθε κύκλος περιλαμβάνει: θέρμανση (αποδιάταξη του DNA), ψύξη (πρόσδεση των εκκινητών) και σύνθεση νέων αλυσίδων από την DNA πολυμεράση. Σε κάθε κύκλο ο αριθμός των μορίων-στόχων διπλασιάζεται.
Εφαρμογές: διάγνωση ασθενειών (π.χ. ανίχνευση ιών), ταυτοποίηση ατόμων και ιατροδικαστική, μελέτη DNA από απολιθώματα και αρχαία δείγματα, προγεννητική διάγνωση.
Την ιδέα της PCR τη σκέφτηκε ο Kary Mullis το 1983, οδηγώντας ένα βράδυ στην Καλιφόρνια, και πήρε γι' αυτή το Νόμπελ Χημείας του 1993. Η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση που την έκανε πρακτική (Taq) προέρχεται από το βακτήριο Thermus aquaticus, που ζει σε θερμές πηγές του πάρκου Yellowstone.
Κάθε κύκλος PCR είναι ζεσταίνω – κρυώνω – χτίζω. Η ζέστη ανοίγει τη διπλή έλικα (αποδιάταξη), το κρύο αφήνει τους εκκινητές να κολλήσουν στα άκρα του στόχου, η θερμοανθεκτική πολυμεράση χτίζει τις νέες αλυσίδες. Κάθε κύκλος διπλασιάζει: 10 κύκλοι ≈ φορές, 20 κύκλοι ≈ ένα εκατομμύριο.
Μέθοδος: επιλογή τεχνικής
- Θέλω όλο το γονιδίωμα ή ρυθμιστικές περιοχές / εσώνια → γονιδιωματική βιβλιοθήκη.
- Θέλω να παράγω πρωτεΐνη σε βακτήριο ή να δω ποια γονίδια εκφράζονται σε ιστό → cDNA βιβλιοθήκη.
- Θέλω να βρω έναν κλώνο → υβριδοποίηση με ανιχνευτή.
- Θέλω γρήγορα πολλά αντίγραφα ενός γνωστού τμήματος από ελάχιστο δείγμα → PCR.
- Σε αριθμητικά: .
Παράδειγμα 1: Σε μια PCR αρχίζουμε με 5 μόρια DNA-στόχου. Πόσα μόρια θα υπάρχουν ιδανικά μετά από 10 κύκλους;
Λύση: μόρια.
Παράδειγμα 2: Κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκες από κύτταρα του παγκρέατος και από κύτταρα του δέρματος του ίδιου ατόμου. Σε ποια θα βρούμε κλώνο με το γονίδιο της ινσουλίνης; Σε ποια το γονίδιο της κερατίνης;
Λύση: Η ινσουλίνη παράγεται από τα β-κύτταρα του παγκρέατος, άρα το mRNA της υπάρχει εκεί: κλώνος ινσουλίνης μόνο στη βιβλιοθήκη του παγκρέατος. Η κερατίνη εκφράζεται στα κύτταρα του δέρματος: μόνο στη βιβλιοθήκη του δέρματος. Στις γονιδιωματικές βιβλιοθήκες θα βρίσκαμε και τα δύο γονίδια.
Άσκηση τύπου Πανελλαδικών: Ένας ερευνητής θέλει να παράγει ανθρώπινη αυξητική ορμόνη σε βακτήρια.
(α) Από ποια βιβλιοθήκη θα απομονώσει το γονίδιο και από ποιο ιστό; (β) Πώς θα εντοπίσει τον σωστό κλώνο; (γ) Αρκεί να εισαγάγει το cDNA στο βακτήριο για να εκφραστεί;
Λύση:
(α) Από cDNA βιβλιοθήκη κυττάρων της υπόφυσης, όπου εκφράζεται η αυξητική ορμόνη. Το cDNA δεν περιέχει εσώνια, οπότε μπορεί να εκφραστεί σωστά στα βακτήρια, που δεν διαθέτουν μηχανισμό ωρίμανσης.
(β) Με υβριδοποίηση: σημασμένος μονόκλωνος ανιχνευτής, συμπληρωματικός προς τμήμα του γονιδίου, ζευγαρώνει μόνο με το DNA του κλώνου που φέρει το γονίδιο, μετά από αποδιάταξη του DNA των αποικιών στο φίλτρο.
(γ) Όχι. Το cDNA δεν έχει υποκινητή. Πρέπει να συνδεθεί με βακτηριακό υποκινητή (και τις κατάλληλες ρυθμιστικές αλληλουχίες) στον φορέα, ώστε να αναγνωριστεί από την RNA πολυμεράση του βακτηρίου.
Γιατί στην PCR χρησιμοποιείται θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση;
Ποιο ένζυμο είναι απαραίτητο για την κατασκευή cDNA από mRNA;
(α) Μια PCR ξεκινά από ένα δίκλωνο μόριο-στόχο και κάνει 5 κύκλους. Πόσα μόρια προκύπτουν, πόσες νέες αλυσίδες συντέθηκαν, πόσοι εκκινητές καταναλώθηκαν και πόσα μόρια αποτελούνται μόνο από νέες αλυσίδες;
(β) Ένας σημασμένος ανιχνευτής φτιάχνεται από το cDNA της ινσουλίνης. Με ποιους κλώνους θα υβριδοποιηθεί: (1) cDNA βιβλιοθήκη από κύτταρα του παγκρέατος, (2) γονιδιωματική βιβλιοθήκη από κύτταρα του δέρματος, (3) cDNA βιβλιοθήκη από κύτταρα του δέρματος;
Δοκίμασε πρώτα μόνος σου — μετά δες τη λύση
(α) μόρια, δηλαδή 64 αλυσίδες. Από αυτές, 2 είναι οι αρχικές, άρα 62 νέες. Κάθε νέα αλυσίδα ξεκινά από έναν εκκινητή: 62 εκκινητές. Οι 2 αρχικές αλυσίδες βρίσκονται σε 2 διαφορετικά μόρια, άρα μόρια έχουν μόνο νέες αλυσίδες.
(β) (1) Ναι: τα κύτταρα του παγκρέατος εκφράζουν το γονίδιο της ινσουλίνης, άρα το mRNA της υπάρχει στη βιβλιοθήκη. (2) Ναι: η γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει όλο το γονιδίωμα, που είναι ίδιο σε όλα τα σωματικά κύτταρα — το γονίδιο υπάρχει ακόμη κι αν δεν εκφράζεται. Ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με τα εξώνια του γονιδίου. (3) Όχι: τα κύτταρα του δέρματος δεν εκφράζουν το γονίδιο, άρα δεν υπάρχει mRNA ινσουλίνης για να γίνει cDNA.
- «Το cDNA περιέχει τον υποκινητή του γονιδίου.» Δεν τον περιέχει· ο υποκινητής δεν μεταγράφεται.
- «Η cDNA βιβλιοθήκη είναι ίδια σε όλους τους ιστούς.» Εξαρτάται από τα γονίδια που εκφράζονται στον ιστό.
- «Η PCR απαιτεί βακτήρια.» Γίνεται εξ ολοκλήρου στον δοκιμαστικό σωλήνα.
- «Ο ανιχνευτής είναι δίκλωνος.» Είναι μονόκλωνος, και το DNA-στόχος πρέπει να αποδιαταχθεί.
- cDNA: mRNA → (αντίστροφη μεταγραφάση) → υβριδικό mRNA–DNA → δίκλωνο cDNA· χωρίς εσώνια και υποκινητή.
- cDNA βιβλιοθήκη: μόνο γονίδια που εκφράζονται στον ιστό· κατάλληλη για παραγωγή πρωτεϊνών σε βακτήρια.
- Υβριδοποίηση: σημασμένος μονόκλωνος ανιχνευτής + αποδιαταγμένο DNA, με βάση τη συμπληρωματικότητα.
- PCR: εκκινητές, θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση, κύκλοι θέρμανσης–ψύξης· .